Untersuchung von Glykosylierungsleistung und intrazellulären Nukleotidzucker-Konzentrationen rekombinanter CHO-Zellen unter hypothermen Kulturbedingungen

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Die Zuckerseitenketten rekombinanter Glykoproteine erfordern die gentechnische Herstellung in Säugerzelllinien, da diese im Gegensatz zu Prokaryoten und einfachen Eukaryoten die notwendigen Enzyme für die Glykosylierung besitzen. Die Biosynthese dieser posttranslationalen Modifikation erfolgt in einem komplexen Netzwerk enzymatischer Reaktionen im Endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat. Externe Faktoren wie Substratkonzentrationen oder Prozessparameter können diesen Prozess beeinflussen und somit die Oligosaccharidstrukturen der Glykoproteine verändern. Während viele Studien diese Einflüsse untersucht haben, wurde die genaue Wirkung externer Faktoren auf die intrazellulären Vorgänge der Glykanbiosynthese bisher selten betrachtet. Ziel dieser Arbeit war es, die intrazellulären Auswirkungen eines Prozessparameters, der die Glykosylierung beeinflusst, auf relevante Metabolite und Enzyme zu analysieren. Hierzu wurden die für die Glykanbiosynthese notwendigen Nukleotidzucker quantifiziert, die von Glycosyltransferasen zu Oligosacchariden verknüpft werden. Zudem sollten die intrazellulären Konzentrationen der Nukleotide, die entscheidend für die Biosynthese der Nukleotidzucker sind, gemessen werden. Dafür mussten Methoden zur Extraktion, Präparation und Messung entwickelt werden. Eine rekombinante CHO-Zelllinie, die das Glykoprotein Erythropoietin exprimiert, wurde verwendet, um einen Prozessparameter zu identifizieren, der d