Generation of pure endothelial cells from transgenic embryonic stem cells exhibiting an endothelial cell-specific expression of green fluorescent protein upon differentiation

Aus embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) abgeleitete Endothelzellen können in Modellen zur Therapie von Erkrankungen, die mit vaskulären Läsionen assoziiert sind, eingesetzt werden. Außerdem geben ES Zellstudien wichtige Einblicke in die Entwicklung und Differenzierung von Endothelzellen im menschlichen Organismus. Für diese Zwecke ist es essentiell, die aus ES-Zellen abgeleiteten Endothelzellen zu markieren und nachzuverfolgen und die differenzierten Zellen schließlich in eine reine Zellpopulation zu überführen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine murine ES-Zell-Linie generiert, welche nach lentivirusbasierter Transduktion von ES Zellen das grün fluoreszierende Protein (GFP) sowie ein Zeocin-Resistenzgen unter Kontrolle des murinen vaskulären endothelialen (VE)-Cadherin-Promotors exprimiert. 192 aus einzel-transduzierten ES-Zellen abstammende ES-Zellkolonien wurden zufällig selektiert. Ab Tag 6 der Differenzierung zeigten 12,5% der Klone GFP-positive vaskuläre Strukturen mit Co-Expression verschiedener vaskulärer Marker (VE-Cadherin, CD31). Die durch Durchflusszytometrie am Tag 8 der Differenzierung selektierten GFP-positiven Zellen zeigten eine signifikant höhere Genexpression verschiedener Endothelzellmarker als die GFP-negative Zellpopulation. Darüber hinaus wurde ein weiteres, auf der Expression von CD31 basierendes Verfahren zur Selektion der aus ES Zellen abgeleiteten Endothelzellen angewendet und das Genprofil der selektierten Endothelzellen zu verschiedenen Zeitpunkten der Differenzierung analysiert. Auf diese Weise wurde der optimale Zeitpunkt für die Isolierung und anschließende Kultivierung und Charakterisierung dieser Zellen festgelegt. Alle untersuchten Marker sowie Transkriptionsfaktoren der Endotheldifferenzierung zeigten eine deutlich höhere Expression in der CD31-positiven gegenüber der -negativen Zellpopulation am Tag 6 und 8 der Differenzierung. Die Kultivierung der CD31- positiven Zellen am Tag 6 der Differenzierung führte zu einer für Endothelzellen charakteristischen Kopfsteinpflastermorphologie mit Co-Expression des GFPs mit verschiedenen endothelialen Markern. Schließlich bildeten die kultivierte Zellen tubuläre Strukturen aus. Zusammenfassend stellt die Generierung embryonaler Stammzellklone, welche während der Differenzierung zu Endothelzellen GFP exprimieren, und die Selektion dieser Zellen auf Basis der Expression von CD31, eine effiziente Methode für die Entwicklung reiner Endothelzellen dar. Diese Studien repräsentieren darüber hinaus die Voraussetzung für zukünftige detaillierte Studien zur Differenzierung von Endothelzellen aus ES Zellen und induzierten pluripotenten Stammzellen, und für die Anwendung Zell-basierter experimenteller therapeutischer Strategien bei verschiedenen vaskulären Erkrankungen.