Gliomzell-Invasion in Abhängigkeit zum GABAA-Rezeptor

Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der Invasion und Migration von glialen Tumorzellen in kultivierten Gehirnschnitten sowie der Proliferation in kultivierten Gliomzellen in Abhängigkeit von der Expression des -aminobuttersäureA (GABAA-) Rezeptors. Um diese Fragestellung beantworten zu können, mußte zuerst ein modifiziertes Schnittmodell etabliert werden. Aus der Literatur sind Schnittmodelle bekannt, die es ermöglichen, Gehirnschnitte über mehrere Wochen zu kultivieren (Stoppini et al. 1991; Ohnishi et al. 1998). Diese Modelle beruhen darauf, dass entweder Tumorzellen auf einem Filter kultiviert werden und diese an der gesamten aufliegenden Fläche des Gehirnschnittes einwandern können; oder dass Spheroide (Tumorzellen, die eine solide Masse bilden) auf den Schnitt aufgebracht werden, von wo Tumorzellen in den Schnitt hinein wandern können. Für diese Arbeit war es wichtig, suspendierte Gliomzellen unterschiedlicher Markierung (rote und grüne Fluoreszenz) gleichzeitig und punktuell an definierter Stelle unter gleichbleibenden Bedingungen in den Gehirnschnitt einzubringen. Daher musste ein den Anforderungen entsprechendes Modell etabliert werden. Zu dieser Etablierung gehörte außerdem die Anpassung einer standardisierten Auswertung der zurückgelegten Distanz invadierender Tumorzellen. Dazu wurde das Computerprogramm „Image pro plus“ (Mikrosoft) herangezogen und auf die Bedingungen des Versuches eingestellt. Je größer die Malignität einer Gliomzelle ist, desto geringer ist die Dichte von -aminobuttersäure (GABA) Bindungsstellen (Jussofie et al. 1994). Die Anwesenheit des Neurotransmitters GABA und seiner spezifischen GABAA-Rezeptoren spielt eine aktive Rolle bei der Inhibition der Proliferation von nicht-malignen aber proliferierenden Zellen (Labrakakis et al. 1998). Davon ausgehend sollte anhand des modifizierten Schnittmodells untersucht werden, ob GABA bzw. die Anwesenheit des spezifischen Rezeptors die Einwanderung von Tumorzellen beeinflusst. Zu diesem Zweck sollten F98-Tumorzellen zum einen mit dem kodierenden Gen für den funktionalen GABAA-Rezeptor und dem kodierenden Gen des grün fluoreszierenden Proteins pEGFP-N1 kotransfiziert werden. Zum anderen wurden F98-Gliomzellen als Kontrolle mit dem kodierenden Gen des rot fluoreszierenden Proteins dsRed2 transfiziert. Die unterschiedliche grüne und rote Markierung der F98-Gliomzellen erlaubte es, beide Zelltypen in den gleichen Schnitt einzubringen und anschließend deren „Invasionsverhalten“ unter dem konfokalen Lasermikroskop auszuwerten. Außerdem sollte untersucht werden, ob die F98-Gliomzellen die mRNA für das Enzym Glutamatdecarboxylase (GAD) besitzen. Dieses synthetisiert aus dem erregenden Neurotransmitter Glutamat durch Abspaltung einer Carboxylgruppe den hemmenden Transmitter GABA und erhöht so den intrazellulären GABA Gehalt. Im gesunden Gehirn kommt GAD ausschließlich in GABAergen Neuronen vor (Forth et al. 1996). In vorangegangenen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass GAD in verschiedenen Tumorgeweben vorhanden ist und dort den GABA Gehalt erhöht (Kleinrok et al. 1998; Opolski et al. 2000; Matuszek et al. 2001). Aus diesen Erkenntnissen entstand die Hypothese, es könnte sich hierbei um einen inhibierenden Effekt der Zelle selbst handeln (Matuszek et al. 2001). Deshalb wurde in dieser Arbeit die RNA der F98-Gliomzellen isoliert und anhand einer RT-PCR untersucht, ob sie für das Enzym GAD kodierende Abschnitte aufweist.