Modifikationen der Atmungskette in Corynebacterium glutamicum und Rolle des Flavohämoproteins Hmp

Corynebacterium glutamicum besitzt eine verzweigte Atmungskette mit zwei terminalen Oxidasen, eine Cytochrom-bd-Oxidase mit einer hohen Sauerstoffaffinität, aber einem niedrigen H+/O-Verhältnis, und eine Protonen-pumpende Cytochrom-aa3-Oxidase mit einer niedrigeren Sauerstoffaffinität, aber einem hohen H+/O-Verhältnis. Die Letztere bildet einen Superkomplex mit einem Cytochrom-bc1-Komplex. Unter aeroben Bedingungen bauen diese beiden Zweige einen elektrochemischen Protonengradienten auf, welcher von der F1FO-ATP-Synthase in der oxidativen Phosphorylierung dazu genutzt wird, ATP zu synthetisieren. In dieser Arbeit wurde die Atmungskette von C. glutamicum modifiziert und die Einflüsse dieser Modifikationen untersucht. Der Cytochrom-bc1-aa3-Superkomplex ist die bedeutendste Protonenpumpe in C. glutamicum. Um den Einfluss höherer zelluläre Mengen des Superkomplexes zu untersuchen, wurde die Expression seiner strukturellen Gene durch den Austausch der nativen Promotoren gegen den Ptuf-Promotor des Elongationsfaktors Tu zweifach erhöht. Im rekombinanten Stamm waren höhere Mengen der Cytochrome a, b und c nachweisbar und ruhende Zellen wiesen eine um 30 % erhöhte Sauerstoffverbrauchsrate auf. Allerdings war das Wachstum mit dem des Wildtyps vergleichbar. In einem ähnlichen Ansatz wurde der native Promotor des atpBEFHAGDC-Operons gegen Ptuf ausgetauscht. Überraschenderweise führte dies zu einer 50-60 % reduzierten Expression der atp-Gene. Dies deutet darauf hin, dass der native atp-Promotor stärker ist als der tuf-Promotor und möglicherweise geeignet sein könnte, um in Produktionsstämmen von C. glutamicum die Genexpression zu erhöhen. Um die Energiekonservierung unter mikroaeroben Bedingungen zu verbessern, wurden Versuche unternommen, die bd-Oxidase durch eine Cytochrom-cbb3-Oxidase aus Bradyrhizobium japonicum, ein Protonen-pumpendes Häm-Kupfer-Enzym mit einer sehr hohen Sauerstoffaffinität, zu ersetzen. Allerdings, da die Synthese des akzessorischen Proteins FixG toxisch für C. glutamicum war, konnte keine funktionale Expression der heterologen cbb3-Typ Oxidase erreicht werden. C. glutamicum besitzt ein limitiertes Potential zu anaerobem Wachstum mittels Nitratatmung durch die Nitratreduktase NarGHJI. Allerdings akkumuliert Nitrit und inhibiert das Wachstum, da eine Nitritreduktase fehlt. Um die Umsetzung von Nitrit zu Ammonium zu ermöglichen und somit die Nutzung von Nitrat als Stickstoffquelle, wurden Versuche unternommen eine dissimilatorische Nitritreduktase aus Wolinella succinogenes und eine assimilatorische Nitritreduktase aus Mycobacterium smegmatis in C. glutamicum zu exprimieren. Jedoch funktionierte die anaerobe Nitritreduktion mit keinem dieser Enzyme. In einem anderen Aspekt dieser Arbeit wurde der Einfluss von Nitrit auf die globale Genexpression untersucht. Das am stärksten durch Nitrit hochregulierte Gen war hmp, welches für ein Flavohämoprotein kodiert. Eine ? hmp-Mutante war unter aeroben Bedingungen sowohl empfindlicher gegenüber Nitrit, als auch gegenüber dem NO-Donor Natriumnitroprussid. Das anaerobe Wachstum dieser Mutante mittels Nitratatmung war ebenfalls stark beeinträchtigt. Demzufolge spielt das Flavohämoprotein Hmp eine wichtige Rolle bei der Antwort auf Nitrit-induzierten Stress in C. glutamicum unter aeroben und anaeroben Bedingungen.